lunes, 6 de enero de 2014

Metabolismo de aminoácidos: Ciclo biogeoquímico y asimilación y fijación del nitrógeno en las plantas

Nitrógeno líquido (para hacer bonito)
En esta entrada vamos a introducir los fundamentos de cómo el nitrógeno elemental presente en el aire y el suelo se incorpora a los organismos. Efectivamente, va a ser una entrada larga y no es un tema especialmente sencillo ni divertido... pero es importantísimo, al final resumiremos por qué, y es que el nitrógeno se trata de un elemento fundamental para todos nosotros: forma parte de los aminoácidos, de los nucleótidos, de decenas de cofactores enzimáticos, de porfirinas, de alcaloides... la hemoglobina de tu sangre, tu ADN, tus proteínas, la cafeína, las clorofilas, la nicotina... todos son compuestos en los que el nitrógeno es clave. Sin él, tal como estamos diseñados, no tenemos nada que hacer.

Hacemos bien empezando esta entrada presentándote el ciclo biogeoquímico del nitrógeno (pincha AQUÍ para ver un dibujo). Básicamente, un ciclo biogeoquímico es una especie de puzzle en el que se indican las diferentes transformaciones que sufre un elemento concreto para pasar de un reservorio ecológico a otro. En el caso del nitrógeno, los tres reservorios naturales principales de éste son la atmósfera, el suelo y la biomasa.
  • En la atmósfera, aunque el nitrógeno (en forma de dinitrógeno) se encuentra en grandes cantidades, los animales no podemos utilizarlo directamente; simplemente no disponemos de ningún mecanismo bioquímico que nos lo permita. El proceso por el que el N2 se incorpora a moléculas orgánicas se conoce como fijación del nitrógeno, y la mayor parte de ésta se produce por acción de microorganismos.
  • En el suelo, la forma primordial en la que se encuentra el nitrógeno es en forma de nitratos (NO3-) y de amonio (NH4+), que son captados por las raíces de las plantas e incorporados a aminoácidos en el conjunto de reacciones conocidas como asimilación del nitrógeno.
  • En la biomasa, pues lo que hemos comentado: se encuentra formando parte de numerosas biomoléculas y también una parte se encuentra como amonio libre o su derivado, la molécula de urea (que es la forma no tóxica en la que algunos animales, como nosotros, eliminamos el amonio residual, que sí es tóxico). Tanto mientras estamos vivos y eliminamos nuestras excreciones como cuando los animales morimos y nuestros restos mortales pasan al mundo mineral, rápidamente microorganismos tipo bacterias y hongos saprófitos empiezan a aprovechar nuestra materia orgánica para nutrirse, liberando este nitrógeno molecular de nuevo al suelo.
  • Las bacterias desnitrificantes pueden convertir por su metabolismo el nitrógeno atrapado en el suelo en nitrógeno gas, que pasa a la atmósfera.
Así es como, a grandes rasgos, se cierra y vuelve a empezar el ciclo del nitrógeno.
 
Ahora vamos a analizar la asimilación y la fijación del nitrógeno, que no tienen nada que ver pero el resultado es el mismo: la transformación del nitrógeno inorgánico en amoniaco/iones amonio, que los organismos vegetales pueden incorporar a sus aminoácidos y de ahí al resto de moléculas nitrogenadas. Los animales no podemos hacer ninguna de las dos cosas, por lo que obtenemos el nitrógeno orgánico alimentándonos de plantas o de animales que previamente se han nutrido de esas plantas. 

La asimilación del nitrógeno ocurre en dos pasos: el primero es la transformación del nitrato en amonio y el segundo es la incorporación de este producto a aminoácidos. Esto ocurre por la acción de una serie de enzimas. 

Las que se encargan del primer paso son la nitrato reductasa y la nitrito reductasa, tal que así:
  • La nitrato reductasa (NR) reduce el nitrato a nitrito en el citoplasma usando un piridín-nucleótido como donador de electrones. El donador más común es el NADH, pero se ha encontrado en algunas especies (véase la soja, el maíz o la cebada) que poseen una isoforma que actúa también con NADPH. En el maíz, la NADPH-NR se encuentra junto con la NADH-NR en las raíces, mientras que en las hojas sólo existe NADH-NR.
    Esta proteína está codificada por un único gen nuclear a partir del cual se sintetiza la apoenzima a la que se unen los diferentes cofactores. La catálisis es mediada por el cofactor de molibdeno, del que no creo que te olvides en cuanto te diga que se abrevia como MoCo.
  • La nitrito reductasa (NiR) reduce el nitrito a amonio en el interior del cloroplasto y utiliza ferredoxina reducida como donador electrónico.
La expresión de estas enzimas está inducida principalmente por la luz y por la presencia de nitrato, y ocurre tanto a nivel transcripcional como a nivel postranscripcional. Se trata de una regulación muy, muy fina y abrumadoramente coordinada pese a que la NR tiene actividad en el citoplasma y la NiR tiene actividad en el citosol. De manera algo simplificada (por supuesto) esto es lo que se ha comprobado:
Si hay nitrato en el medio, se expresan los genes que codifican las enzimas que lo convierten en amonio; si no hay nitrato, no se generarán las enzimas. La luz, por su parte, estimula la síntesis de NR a través de la activación del fitocromo y aumentando la concentración de azúcares (por fotosíntesis). Sin embargo, concentraciones altas de glutamina o glutamato actúan como represoras de la transcripción de los genes a ARNm. Esto puedes razonarlo como: si hay nitrato en el medio y lo necesito, genero las enzimas para utilizarlas; si no hay nitrato en el medio o lo hay pero no lo necesito porque ya tengo suficiente nitrógeno orgánico, me ahorro la producción de enzimas. Lógico, ¿no?
Se sabe que hay un factor plastídico que actúa como señal para que el nitrato y la luz activen la síntesis de NR y que al mismo tiempo induce la expresión de NiR, pero se desconoce su naturaleza.
Estos mecanismos a nivel transcripcional afectan a la cantidad de enzima, pero a mayores existe un mecanismo a nivel postranscripcional que afecta a su actividad: la NR se activa en presencia de luz e inactiva en oscuridad por un mecanismo de fosforilación/desfosforilación. En oscuridad, una quinasa fosforila un residuo de serina de la NR al que se une entonces una proteína represora (NIP 14-3-3); en iluminación, una fosfatasa elimina el grupo fosfato de la serina, y la enzima vuelve a estar activa. Realmente la NR no se inactiva en la oscuridad del todo, pero la actividad es mucho, mucho menor.
Para entender cómo se regula la actividad de la NiR con la luz sólo hay que pensar en que el donador de electrones que utiliza es la ferredoxina reducida. ¿Qué reducía la ferredoxina? El fotosistema I de la cadena de transporte electrónico en el tilacoide del cloroplasto cuando sus clorofilas se excitaban al recibir el impacto de un fotón. Por tanto, si no hay luz, no se excitan las clorofilas y la ferredoxina no se reduce, así que no hay actividad nitrito reductasa.
¿Te has dado cuenta de cómo en oscuridad ni la NR ni la NiR funcionan y de que existe un factor que estimula su síntesis aun trabajando en lugares diferentes de la célula? Esto tiene un significado lógico si tenemos en cuenta que el nitrito es muy reactivo y, por tanto, tóxico. Si la nitrato reductasa estuviera funcionando sin la consonancia que tiene con la nitrito reductasa, se acumularía nitrito en la célula y ésta podría morir envenenada. Sin embargo, el mecanismo está fuertemente regulado para que eso no suceda: o funcionan las dos o no funciona ninguna (por lo menos de forma en que la célula pueda sufrir daños por acumulación de nitrito).
Fuere como fuere, la conclusión es que gracias a su acción coordinada se obtiene amonio en las células vegetales a partir de los nitratos absorbidos del suelo por la raíz. El amonio también puede proceder de la fotorrespiración y del catabolismo de proteínas, y pasará a formar parte de los aminoácidos mediante la acción de otras dos enzimas, las de la segunda fase: la glutamina sintetasa (GS) y la glutamato sintasa (GOGAT; de glutamina:2-oxoglutarato aminotransferasa). Juntas conforman el ciclo GS/GOGAT.

(Un detalle de nomenclatura: sintetasa hace referencia a que la enzima hidroliza ATP; sintasa hace referencia a que la enzima no hidroliza ATP. Es una tontería pero hay que distinguirlo).
  1. La primera reacción del ciclo GS/GOGAT es catalizada por la glutamina sintetasa, que acoplando la hidrólisis de una molécula de ATP incorpora ion amonio a la cadena lateral del aminoácido glutamato, resultando glutamina.

    Existen varias isoformas de glutamina sintetasa con diferente composición de subunidades y distinta localización (que si citosólica, que si plastídica, que si en las hojas, que si en la raíz), pero no vamos a exponerlas en este blog porque no procede rizar TANTO el rizo.
  2. La segunda reacción del ciclo GS/GOGAT es catalizada por la glutamato sintasa, en la que un donador de electrones (NADH o Fd-reducida) se invierten en dar glutamato por incorporación del grupo amino radical de la glutamina al alfa-cetoglutarato. No es exactamente una reacción de transaminación porque no es el intercambio de un grupo amino por un grupo ceto entre un aminoácido y un cetoácido; en las reacciones de transaminación, por definición, no salen como producto dos aminoácidos, como es este el caso.

    Las isoformas Fd-GOGAT y NADH-GOGAT se encuentran en lugares distintos de la planta y están codificadas por diferentes genes. Fd-GOGAT es la predominante en las partes verdes, en los cloroplastos, y tiene importancia para asimilar el amonio captado y producido por reducción del nitrato; NADH-GOGAT es propia de los tejidos no fotosintéticos como las raíces y tiene más importancia para asimilar el amonio generado por fijación del nitrógeno atmosférico.
A partir de este ciclo, que se regula por la fuente de nitrógeno, este elemento queda incorporado en la glutamina, que por diferentes reacciones de transaminación puede dar lugar a otros aminoácidos y pasar a formar parte de otros compuestos como nucleótidos o porfirinas.



Radicalmente... era un chiste... por los nódulos
de las raíces... ¿lo pillas?
Jajajajajaja ja ja... ja... ja... ejem...
Hasta aquí la asimiliación de nitrógeno del suelo... pero la historia cambia para el nitrógeno atmosférico radicalmente, y es que las plantas no pueden fijar por sí mismas el N2 porque carecen de la enzima que cataliza esta transformación: la nitrogenasa. Esta enzima es, por lo que sabemos, exclusiva de procariotas y las plantas sólo pueden aprovecharse de ellas estableciendo relaciones simbióticas con bacterias fijadoras

Existen muchos tipos de organismos fijadores de nitrógeno, y están presentes en casi todos los ecosistemas. Sus niveles de tolerancia al oxígeno del aire son variables, desde bacterias fijadoras anaerobias estrictas que mueren en su presencia hasta anerobios facultativos, microaerófilos y aerobios facultativos. Puede sonar improcedente fijarnos en este detalle, pero tiene su motivo: por su composición, la nitrogenasa es terriblemente sensible al oxígeno y se inutiliza de forma irreversible en su presencia. De hecho, los microorganismos anaerobios facultativos solamente fijan N2 en ausencia de O2. Los fijadores aerobios cuentan con diferentes formas de eliminar el oxígeno de las inmediaciones de la nitrogenasa: Azotobacter, por ejemplo, incrementa su tasa respiratoria variando los niveles de citocromos y forma complejos inactivos pero protectores de la nitrogenasa con una tercera ferrosulfoproteína.

Decimos tercera porque la nitrogenasa ya consta de dos ferrosulfoproteínas. Si quieres conocer con detalle la estructura de la nitrogenasa te invito a que consultes alguno de los libros presentados en la bibliografía recomendada en la sección Sobre el Blog, pero podemos adelantar que consta de dos ferrosulfoproteínas: la Fe-proteína (que contiene un centro hierro-azufre) y la FeMo-proteína, que además de cuatro centros hierro-azufre contiene dos centros de hierro-molibdeno (que conforman el cofactor hierro-molibdeno o FeMoCo). La Fe-proteína enlaza ATP·Mg y reduce la FeMo-proteína, que se vuelve capaz así de reducir el N2, su sustrato. (Realmente muchas reacciones metabólicas hasta nuestras requieren ATP·Mg, pero se obvia este detalle para simplificar y decimos que simplemente se gasta ATP).

La reacción parece difícil de seguir. En todos los libros en los que he mirado aparece algo confusa porque realmente es difícil de representar de una forma breve y limpia sobre el papel, pero básicamente es una serie de ocho transferencias electrónicas, siempre desde la Fe-proteína a la FeMo-proteína. Las tres primeras veces es para reducir lo suficiente el átomo de molibdeno que fijará literalmente el nitrógeno molecular. Las dos siguientes reducirán uno de los dos átomos de nitrógeno para liberar la primera molécula de amoniaco. Cinco vueltas más tarde se liberará la segunda y el cofactor de hierro-molibdeno volverá a su estado inicial para volver a empezar.


La ecuación neta global queda así. Si te fijas, para una sola molécula de N2 se invierten nada menos que 16 ATP·Mg: energéticamente, la fijación de dinitrógeno es escandalosamente cara. Esto requiere un aporte de nutrientes muy alto, y ahí entran en juego las interacciones planta-microorganismo. Muchos microorganismos solamente fijan nitrógeno en simbiosis; algunos lo hacen estando libres, pero otros solamente expresan la actividad nitrogenasa en simbiosis. Las más conocidas son las que se establecen entre las raíces de las plantas leguminosas (familia Fabaceae) y bacterias rizobio (géneros Rhizobium y afines). Cuando se encuentran en el mismo entorno, los rizobios infectan las raíces de las leguminosas y producen en ellas unas estructuras a modo de tumor que conocemos como nódulos fijadores.
Los rizobios son bacterias gramnegativas que viven en el suelo y que, de forma libre, no expresan actividad nitrogenasa. Para que ésta se manifieste tiene que... bueno... tiene primero que haber una leguminosa en sus inmediaciones. Para dar la señal a las bacterias de que está ahí, la leguminosa libera por la raíz ciertos compuestos flavonoides (cada especie de leguminosa libera sus propios flavonoides específicos) que, a concentraciones del orden nanomolar, atraen quimiotácticamente a los rizobios hacia la fuente. Cuando éstos se encuentran con la raíz, donde la concentración es del orden micromolar, los mismos flavonoides inducen la expresión de los genes nod (responsables de la nodulación), mientras unas aglutininas denominadas leptinas, también expulsadas por las raíces, concentran a los rizobios (la verdad es que las plantas expulsan más sustancias por las raíces de las que uno se puede pensar...). Ha comenzado el proceso de infección.  
Se han descrito varias formas, pero la más estudiada por la que ocurre esta infección es a través de los pelos radicales: los rizobios digieren la pared de celulosa y quedan envueltos en una estructura tubular conocida como cordón de infección, que se extiende hacia el interior de la raíz, hacia el haz vascular. En los nódulos de crecimiento determinado, de duración caduca, sólo se infecta a unas pocas células; en los de crecimiento indeterminado, el propio haz vascular es infectado. Depende de la especie de leguminosa. Las células se infectan por liberación de los rizobios del cordón de infección por un proceso similar a la endocitosis, quedando envueltos en vesículas llamadas simbiosomas. Técnicamente ahora ya habría que llamarlos bacteroides, pues no son como las bacterias que vivían en el suelo: éstos tienen, entre otras cosas, actividad nitrogenasa, y las células vegetales infectadas empiezan a proliferar para formar el nódulo. 
La relación leguminosa-rizobio es de tipo mutualista: la planta proporciona y garantiza a los rizobios los carbohidratos (fuente de energía y carbono orgánico) para su metabolismo (el oxígeno es cuidadosamente llevado hasta ellos a través de laproteína transportadora leghemoglobina) y ellos le rinden a cambio amonio a partir del antes inaccesible dinitrógeno atmosférico (que se filtra en el suelo pues por la propia capa de aire, el arrastre de la lluvia...). Este amonio se asimila por el ciclo GS/GOGAT. Si recuerdas, un participante de este ciclo era el alfa-cetoglutarato, intermediario del ciclo de Krebs, que funciona con oxalacetato y acetil-CoA, que proceden de la glucosa, que procede de la sacarosa exportada desde las hojas y producida por la fotosíntesis. Es decir, que las plantas llevan a los nódulos los carbohidratos que usarán los rizobios y que también usarán para captar el amonio que éstos liberan a aminoácidos, y de ahí al resto de moléculas nitrogenadas.
¿No te parece retorcido? Este es el motivo por el que en agricultura es buena idea practicar la rotación de cultivos: una temporada se tiene la tierra con leguminosas (tréboles, habas, lo que sea) y a la siguiente temporada plantar los vegetales de verdadero interés, pues garantizamos que el suelo está enriquecido. 
En realidad, toda esta perorata tiene un trasfondo de importancia capital. La fisiología vegetal, que siendo sinceros efectivamente puede parecer poco práctica al principio, tiene aplicaciones brutales. Entender cómo las plantas se hacen con el nitrógeno, cómo funciona la nitrogenasa, cómo se pueden mejorar los sistemas y técnicas de cultivo, cómo se puede utilizar mejor los fertilizantes (o incluso prescindir de muchos de ellos), cómo se pueden aprovechar las simbiosis naturales o eliminar la contaminación... se trata de nuestros alimentos y de la biosfera entera... y puede resultar muy (muy) aburrido estudiar el mecanismo de reacción de una enzima o cómo se regula o dónde va cada isoforma y cómo se regula... pero entender esta bioquímica es la llave. ¿A dónde? Bueno, eso está por ver.
 
Espero que te haya gustado esta entrada.
Si quieres saber más sobre el tema, por supuesto consulta la bibliografía recomendada en la sección Sobre el Blog.


Quería empezar el año con una entrada fuerte...

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